RIPA裂解液(中)
RIPA 裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液,裂解得到的蛋白样品可用于常规的 Western、IP 等。蛋白样品可用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去污剂,不能用 Bradford 法测定 RIPA 裂解后的蛋白浓度。RIPA 裂解液有多种,根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。选择合适的 RIPA 裂解液或其它裂解液。
本产品已添加 sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA 和 leupeptin 等多种抑制剂,可有效抑制蛋白降解。如需添加 PMSF,请在临用前加入。
使用方法
对于培养细胞样品:
1. 融解RIPA 裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF 的最终浓度为1 mM。
2. 对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1 - 2秒后,细胞就会被裂解。
3.对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指将细胞弹散。按照6孔板每孔细胞加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,须分装成50 - 100万细胞/管,然后再裂解。
裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150 μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200 μl或250 μl。
对于组织样品:
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解RIPA 裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1 mM。
3. 按照每20 mg组织加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。
4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
5. 充分裂解后,10000 - 14000 g离心3 - 5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈涡旋震荡使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
注:RIPA 裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。如不检测和基因组DNA 结合特别紧密的蛋白,可直接离心取上清用于后续实验;如需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,可通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如检测一些常见的转录因子,例如 NFκB、p53 等时,通常不必进行超声处理,就可检测到这些转录因子。
裂解液选择指南
目录号 | KW1011 | KW1012 | KW1014 | KW1016 | KW1018 | KW1019 |
产品名称 | RIPA裂解液 (中) | RIPA裂解液 (强) | RIPA裂解液 (弱) | Western及IP 细胞裂解液 | NP-40裂解液 | SDS裂解液 |
有效裂解成分 | 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS | 1% NP-40, 0.25% deoxycholate |
1% Triton X-100 |
1% NP-40 |
1% SDS |
裂解强度 | 中 | 强 | 温和 | 温和 | 温和 | 强 |
膜蛋白 的提取 |
较好 |
很好 |
一般 |
一般 |
一般 |
很好 |
胞浆蛋白 的提取 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
核蛋白 的提取 |
较好 |
很好 |
较好 |
较好 |
较好 |
较好 |
胞浆磷酸化 蛋白提取 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
细胞核转录 因子提取 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
很好 |
主要用途 | WB, IP | WB, IP | WB, IP, co-IP | WB, IP, co-IP | WB, IP, co-IP | WB, ChIP |