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RIPA裂解液(中)

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RIPA裂解液(中)

RIPA 裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液,裂解得到的蛋白样品可用于常规的 WesternIP 等。蛋白样品可用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去污剂,不能用 Bradford 法测定 RIPA 裂解后的蛋白浓度。RIPA 裂解液有多种,根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。选择合适的 RIPA 裂解液或其它裂解液。

本产品已添加 sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA 和 leupeptin 等多种抑制剂,可有效抑制蛋白降解。如需添加 PMSF,请在临用前加入。


使用方法

对于培养细胞样品:

1. 融解RIPA 裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF 的最终浓度为1 mM。

2. 对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1 - 2秒后,细胞就会被裂解。

3.对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指将细胞弹散。按照6孔板每孔细胞加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,须分装成50 - 100万细胞/管,然后再裂解。

裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150 μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200 μl或250 μl。

对于组织样品:

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解RIPA 裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使 PMSF 的最终浓度为 1 mM。

3. 按照每20 mg组织加入150 - 250 μl裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。

4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

5. 充分裂解后,10000 - 14000 g离心3 - 5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈涡旋震荡使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。


注:RIPA 裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。如不检测和基因组DNA 结合特别紧密的蛋白,可直接离心取上清用于后续实验;如需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,可通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如检测一些常见的转录因子,例如 NFκB、p53 等时,通常不必进行超声处理,就可检测到这些转录因子。

裂解液选择指南

目录号

KW1011

KW1012

KW1014

KW1016

KW1018

KW1019

 

产品名称

RIPA裂解液

()

RIPA裂解液

()

RIPA裂解液

()

WesternIP

细胞裂解液

NP-40裂解液

SDS裂解液

 

有效裂解成分

1% NP-40,

0.5%

deoxycholate, 0.1% SDS

1% Triton

X-100, 1%

deoxycholate, 0.1% SDS

1% NP-40,

0.25%

deoxycholate

 

1% Triton X-100

 

 

1% NP-40

 

 

1% SDS

裂解强度

温和

温和

温和

膜蛋白

的提取

 

较好

 

很好

 

一般

 

一般

 

一般

 

很好

胞浆蛋白

的提取

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

核蛋白

的提取

 

较好

 

很好

 

较好

 

较好

 

较好

 

较好

胞浆磷酸化

蛋白提取

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

细胞核转录

因子提取

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

很好

 

主要用途

WB, IP

WB, IP

WB, IP,

co-IP

WB, IP,

co-IP

WB, IP, co-IP

WB, ChIP

说明书

 

RIPA裂解液(中).pdf