RIPA裂解液 (强)
货号:KWB002 规格:100ml 保存:-20℃ 有效期:一年
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RIPA裂解液是一种传统的细胞组织快速裂解液,裂解得到的蛋白样品可用于常规的Western、IP等。蛋白样品可用BCA蛋白浓度测定总蛋白浓度,由于含有较高浓度的去污剂,不能用Bradford法测定RIPA裂解后的蛋白浓度。RIPA裂解液有多种,根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。
本产品已添加sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多种抑制剂,可有效抑制蛋白降解。如需添加PMSF,请在临用前加入。
1.融解RIPA裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1 mM。
2.对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。
离心收集细胞,用手指将细胞弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,须分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。
裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150 μl裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200μl或250μl。
1.把组织剪切成细小的碎片。
2.融解RIPA裂解液,混匀。取适量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
3.按照每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。
4.用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
5.充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6.如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈涡旋震荡使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
注:RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。如不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白,可直接离心取上清用于后续实验;如需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,可通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如检测一些常见的转录因子,例如NFκB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可检测到这些转录因子。
1. 请在使用本产品前仔细阅读说明书。本产品仅用于科研,不可用于诊断。
2. 为了您的安全和健康,请穿戴实验防护服、手套、口罩等必要的防护装备。
3. 为达到最佳的裂解效果,尽量避免过多的反复冻融。可适当分装后使用。
4. 需自备PMSF。PMSF(WB018或WB0181) 可向联科订购。
5. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或2-8℃进行。