目录号       KWB004

保存方法     -20℃ 一年

产品规格     100ml

产品简介

      该 RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA 裂解液（弱）裂解得到的蛋白样品可以用于常规的 Western、免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

      RIPA 的本意是 Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA 裂解液的配方有很多种，根据其 裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。

RIPA裂解液(弱)的主要成分为50mM  Tris  (pH7.4)，150mM  NaCl，1% NP-40，0.25%  sodium  deoxycholate，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。

用 RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。 由于含有较高浓度的去垢剂，不能用 Bradford 法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。 

使用说明：

对于培养细胞样品：

1. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2-10min。

3. 对于悬浮细胞：离心收集细胞，轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。轻弹管底以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

4. 对于细菌或酵母：对于1ml菌液或酵母液，离心去上清，如果有必要可以使用PBS洗涤一次，充分去除液体后，轻轻vortex或者弹击管底以把细菌或酵母尽量弹散。加入100-200微升裂解液，轻轻vortex或者弹击管底以混匀，冰上裂解2- 10min。如果希望获得更好的裂解效果，细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用本裂解液进行裂解。

5. 裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞或者1ml的菌液或酵母液中的细菌和酵母量加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。每100万动物细胞用100微升本产品裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为2-4mg/ml，不同细胞有所不同。

6. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

对于组织样品： 

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

3. 按照每20毫克组织加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液进行裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g离心3- 5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。

6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

 注意事项：

1. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。

2. 需自备 PMSF。

3. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。

4. 可能需要通过一些预实验来摸索最佳的适合您实验条件的裂解液。

5. 为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。