目录号 KWB004
保存方法 -20℃ 一年
产品规格 100ml
产品简介
该 RIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA 裂解液(弱)裂解得到的蛋白样品可以用于常规的 Western、免疫沉淀(immunol precipitation,IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。
RIPA 的本意是 Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA 裂解液的配方有很多种,根据其 裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。
RIPA裂解液(弱)的主要成分为50mM Tris (pH7.4),150mM NaCl,1% NP-40,0.25% sodium deoxycholate,以及sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白降解。
用 RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品,可以用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。 由于含有较高浓度的去垢剂,不能用 Bradford 法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。
使用说明:
对于培养细胞样品:
1. 融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM,或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
2. 对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2-10min。
3. 对于悬浮细胞:离心收集细胞,轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。轻弹管底以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。
4. 对于细菌或酵母:对于1ml菌液或酵母液,离心去上清,如果有必要可以使用PBS洗涤一次,充分去除液体后,轻轻vortex或者弹击管底以把细菌或酵母尽量弹散。加入100-200微升裂解液,轻轻vortex或者弹击管底以混匀,冰上裂解2- 10min。如果希望获得更好的裂解效果,细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化,然后再使用本裂解液进行裂解。
5. 裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞或者1ml的菌液或酵母液中的细菌和酵母量加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。每100万动物细胞用100微升本产品裂解后获得的上清,其蛋白浓度约为2-4mg/ml,不同细胞有所不同。
6. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
对于组织样品:
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM,或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
3. 按照每20毫克组织加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。可以把组织样品冷冻后液氮研磨,研磨充分后加入裂解液进行裂解。
5. 充分裂解后,10000-14000g离心3- 5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清,其蛋白浓度约为15-25mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。
6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈 vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
注意事项:
1. RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。
2. 需自备 PMSF。
3. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或 4℃进行。
4. 可能需要通过一些预实验来摸索最佳的适合您实验条件的裂解液。
5. 为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。
6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。