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蛋白样品制备是免疫印迹(Western Blot)的第一步，也是决定实验成败的关键步骤之一。在蛋白提取和定量后，需要加入蛋白上样缓冲液对蛋白进行处理，使蛋白样本能在电泳中进行分离。一般用于Western Blot的抗体只能识别抗原蛋白中的线性序列结构表位(一级结构)，因此，为使抗体能够结合该表位而需要将蛋白样品进行变性，使之打开折叠的空间结构。还原/变性蛋白上样缓冲液中含有的SDS可断裂蛋白分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，同时SDS也与蛋白疏水区结合，由于SDS带大量的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使其均带有相同密度的负电荷。缓冲液中的强还原剂则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，分子被解聚成组成它们的多肽链。

某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要使用非变性蛋白样品进行电泳，抗体的说明书一般会标注。非变性电泳的样品和电泳缓冲液中均不加 SDS，蛋白样品也不需加热变性。有的抗体仅仅识别非还原形式的蛋白，如氧化形式(特别是半胱氨酸残基)的蛋白，此时还原剂也必须从上样缓冲液和电泳缓冲液中除去。

本非变性蛋白上样缓冲液(5×)，是一种经过改良的以溴酚蓝为染料、5倍浓缩的蛋白上样缓冲液，不含SDS等变性试剂，但含有还原剂，可用于常规的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)蛋白样品的上样。

使用方法

1. 在室温或不超过 37℃的水浴中溶解非变性蛋白上样缓冲液(5×)。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。

2. 以每4μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液(5×)的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5×)。

3. 必要时可高速离心样本5-10分钟，将沉淀物离心到管底。冷却到室温后，取上清上样到非变性胶加样孔内即可。一般电泳每孔上样量为20μl，样品蛋白量不小于20μg。

4. 通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。