应用简介

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡，是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

技术原理

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

样本要求（需低温保存运输）：

   1）细胞样本：需为单细胞悬浮状态，1-3*10的6次方个，细胞状态良好，活率95%以上，无污染。
   2）外周血：24h内采集的EDTA或肝素抗凝全血5ml左右，无对人体有害的病原体污染。
   3）新鲜组织：2h内采集的小鼠、大鼠等脾、骨髓、胸腺、淋巴结等新鲜组织大约50mg。

公司交付

实验原始图、分析图和PDF版实验报告

结果案例

实验流程

1、收集上清：收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

2、收集细胞：六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1 mL无EDTA 0.25%胰酶，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，1500 rpm离心5 min，弃上清。

3、PBS洗涤细胞：加入3mL 4℃预冷的 PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀用200μL 的Binding Buffer重悬。

4、荧光标记：加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL Propidium Iodide，混匀。室温下避光反应15min。

5、于1 hour内上机检测：

　　Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下：激发波长Ex=488nm，发射波长FL1(Em=525±20nm);FL2(Em=585±21nm)。用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要是早凋、晚凋与死亡)的比例及数目。

注意事项

1. 使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁。
2. 如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响Annexin V的结合。
3. Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。
4. 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4 °C下操作，以免影响细胞状态。
5. 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。
6. 为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。
7. PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。