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流式细胞凋亡

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应用简介

细胞凋亡是细胞主动实施的一种程序性死亡,是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。


技术原理

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。因此Annexin V作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinⅤ进行荧光素FITC标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


样本要求(需低温保存运输):

   1)细胞样本:需为单细胞悬浮状态,1-3*10的6次方个,细胞状态良好,活率95%以上,无污染。
   2)外周血:24h内采集的EDTA或肝素抗凝全血5ml左右,无对人体有害的病原体污染。
   3)新鲜组织:2h内采集的小鼠、大鼠等脾、骨髓、胸腺、淋巴结等新鲜组织大约50mg。

公司交付

实验原始图、分析图和PDF版实验报告

结果案例

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实验流程

1、收集上清:收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

2、收集细胞:六孔板中的细胞用PBS洗涤一次,加入1 mL无EDTA 0.25%胰酶,待细胞变圆且有部分细胞悬浮,即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞,使细胞悬浮。收集于流式管中,1500 rpm离心5 min,弃上清。

3、PBS洗涤细胞:加入3mL 4℃预冷的 PBS完全重悬细胞,1500 rpm离心5 min,弃上清。沉淀用200μL 的Binding Buffer重悬。

4、荧光标记:加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀。室温下避光反应15min。

5、于1 hour内上机检测:

  Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测,PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下:激发波长Ex=488nm,发射波长FL1(Em=525±20nm);FL2(Em=585±21nm)。用FlowJo软件分析细胞不同状态(主要是早凋、晚凋与死亡)的比例及数目。

注意事项

  1. 使用前低速离心,以免液体积存管盖和管壁。
  2. 如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤,清除EDTA,以免残余的EDTA与Ca2+螯合,影响Annexin V的结合。
  3. Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。在处理和标记时,尽可能在暗处进行。在孵育阶段,用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后,在暗室内用显微镜观察。
  4. 整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4 °C下操作,以免影响细胞状态。
  5. 在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留,有可能会影响实验结果。
  6. 为防止荧光衰变,宜在1小时内进行流式检测。
  7. PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-FITC染色,最短可在上机前5分钟再加入PI染色。